弗莱明观察实验非常认真，但他总不喜欢及时清理实验台上的培养皿。但就是这一不良习惯导致了20世纪医学上最伟大的发现。1928年初夏的一天，弗莱明发现一个培养皿中，葡萄球菌暴露在空气之中，受到一种毛绒状的霉污染。但霉菌的周围却没有其他细菌生长。这一惊奇发现使弗莱明立刻意识到这种霉在生产某种对葡萄球菌有害的物质。不久他就证明了自己的推断，并且发现这种物质还能抑制许多其它有害细菌的生长，且对人或动物都无毒作用。这就是堪称拯救了人类的医药物质──青霉素。
第二年，弗莱明将自己的研究成果发表，但并没有引起想象的那样轰动，甚至无人问津。弗莱明坚信青霉素的发现对于人类将会有不可估量的影响，但面临的重大难题就是自己找不到一种提纯青霉素的有效办法。以至于青霉素被发现之后十几年内都未得到人们的认可及应用。1932年，弗莱明停止了对青霉素的猾研究，并把样本送给了那些需要的科学家。
青霉素重获生机应归功于病理学家霍德华·瓦尔特·弗洛里和英国的生物化学家恩斯特·鲍里斯·钱恩。正是他们翻阅了弗莱明的论文，重新研究青霉素的性质、分离和化学结构，最终找到提出纯青霉素的方法，青霉素才得以在临床上应用并获得大规模生产。而正是青霉素的发现和广泛使用，才引发了医学界寻找抗菌素新药的，使人类进入了合成新药的时代。
青霉素使无数面临死亡威胁的病人得到挽救，特别是在第二次世界大战期间，它的神奇作用更发挥到了极致，医好了成千上万的伤病员。以致人们一致把青霉素和原子弹、雷达并称为二次大战中的三大发明。弗莱明也因青霉素的神奇效力声名远播，收获了一个又一个奖项。一直到去世为止，他都享受这一名望带来的幸福。
成名之后的弗莱明并没有把这一伟大发现归为己有。他在演讲时多次强调说，青霉素的诞生要归功于弗洛里、钱恩以及他的同事们。1945年，弗莱明、钱恩和弗洛里三人因青霉素的发现和应用共同获得诺贝尔生理学和医学奖。
1955年3月11日，弗莱明逝世。他的遗体被安葬在伦敦圣保罗大教堂。
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