1922年他患了重感冒，不停地流鼻涕。他把这些分泌物培养成菌苗，作为研究材料。4天后，他发现这些分泌物变成了一大团淡黄色的微生物。他将少许稀薄鼻腔粘液加入这些微生物，结果出现了让人意想不到的事情：微生物被粘液杀死！长期以来一筹莫展的弗莱明顿时兴奋起来，他继续研究，发现这种能够将细菌杀死的抗毒物质不仅存在于鼻涕中，唾液中有，眼泪中有，人的大部分器官和组织中也有，而血液里包含得更多。进一步的实验表明，这种神奇的物质还存在于鸡蛋和牛奶中。于是弗莱明得出一句结论：抗生素是一种分布非常广泛的抗菌酵母，它也许是动物细胞与生俱来而构成的基本杀菌物。1922年，弗莱明完成了一份题目为《皮肤组织和分泌物中所发现的奇特细菌》的报告。虽然这份报告并没有引起人们的关注，但不可否认的是，弗莱明已经发现了抗生素。
尽管这种抗生素的生成情况对弗莱明来说依然是一个待解的谜，但这个新发现却给弗莱明带来了希望和勇气，促使他不断从事这方面的研究。
1928年夏季的一天，弗莱明像往常一样，按时来到圣玛丽医院那阴暗的实验室。当他将培植葡萄球菌的玻璃器皿打开时，发现器皿的边缘产生了灰绿色的霉菌层，他培植的细菌已经腐烂。显然，在他上一次工作时，霉菌孢子落入了器皿，将葡萄球菌杀死。在实验过程中，这种情况是经常发生的。但这一次，弗莱明没有像往常那样倒掉器皿里的东西，而是好奇地观察了起来。他发现，当葡萄球菌布满培养基的整个平面时，霉菌周围仍旧没有细菌。这就是说，霉菌阻止了细菌的蔓延，并最终消灭了它。为了对眼前所看到的一切进行确认，弗莱明重复实验，结果证明了他观察到的现象是必然的，而不是偶然的。这种能够杀菌的物质对人体是否有害呢？弗莱明先用兔子作试验，又用白鼠作试验，结果非常良好。
弗莱明把这一重要发现写成学术论文，发表在1929年英国的《实验病理季刊》上，在论文里，他把这种分泌物命名为青霉素（即盘尼西林）。论文指出，青霉素不干扰白血球功能，对实验动物无毒，可能是一种适用于注射的杀菌剂，具有重要的医用价值。
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